分光光度法测定弹性溶解活性的方法
以下步骤以使用弹性罗丹明为例，200-400目. 其他基质也可以同样使用. 每种衬底经弹性蛋白酶溶解后具有不同的吸光度. 染色弹性蛋白的可溶性肽的吸光度如下;
弹性罗丹明，550nm
弹性荧光素，495 nm
Elastin-Orcein, 570 nm
弹性刚果红，485纳米
Elastin-Remazol, 595 nm
该过程严格遵循已发表的方法(9,10,11,35,36).
步骤1. 已知数量的基材完全被弹性蛋白酶溶解. 确定了每毫克衬底的光密度.
步骤2. 已知数量的弹性蛋白酶与衬底孵育. 每毫克弹性蛋白酶溶解的底物量(i.e.(具体活性)确定. 未知物质的弹性溶解活性可以通过与弹性蛋白酶活性的比较来确定.
所需的材料
1. 底物 Suspension; 20mg/ml in 0.2 M Tris-HCl pH 8.8.
2. 缓冲; 0.2 M Tris pH值8.8.
3. 弹性蛋白酶; 2X crystallized or chromatographically purified.
4. 锥形瓶，10-25毫升大小或试管.
5. Dubnoff type incubator; equilibrated at 37°C.
6. 电磁搅拌器.
7. 冰浴.
8. 滤纸，Whatman No 41或同等产品.
步骤1. 溶解基板光密度的测定
检查以下方案和移液管缓冲液，然后弹性到10毫升烧瓶. 通过磁力搅拌使底物保持悬浮状态，用1向烧瓶中加入等分.0毫升吹出吸管. NOTE> The elastase aliquot should contain 20-30 units activity. 这是一个多余的量，需要在30-60分钟内完全溶解底物.
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观察到的 |
O.D. 每毫克 |
| 瓶 |
缓冲 |
弹性蛋白酶 |
底物 |
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O.D. |
衬底(计算) |
| (No.) |
(ml) |
(ml) |
(ml) |
(mg) |
-------- |
-------- |
| 1(空白) |
2.90 |
0.10 |
0 |
0 |
-------- |
-------- |
| 2 |
2.65 |
0.10 |
0.25 |
5.0 |
-------- |
-------- |
| 3 |
2.40 |
0.10 |
0.50 |
10.0 |
-------- |
-------- |
| 4 |
2.15 |
0.10 |
0.75 |
15.0 |
-------- |
-------- |
| 5 |
1.90 |
0.10 |
1.00 |
20.0 |
-------- |
-------- |
堵住烧瓶，以每分钟40-60次的速度在37°的温度下孵育，直到所有底物都被溶解(30 -60分钟)。. 用缓冲液将音量调至10ml并读取O.D. 在10毫米的比色皿中对着毛坯. 必须准备二次稀释，以使所有读数都在分光光度计的范围内. 记录每个O.D. 每毫克(乘以稀释因子)，计算O.D. 每毫克底物. O.D. 每毫克应接近恒定(±5%). O的一幅图.D. Vs底物的mg应该是一条直线.
步骤2. 单位弹性活性测定
检查以下方案和移液管缓冲液，然后弹性蛋白酶，然后底物到10毫升烧瓶. 输送等分液时，保持底物悬浮状态. 弹性蛋白酶浓度应为0.2毫克/毫升缓冲液.
消光系数:Î， 1%， 280 nm = 19.5 A280x 0.51 = mg/ml
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观察到的 |
O.D. 每毫克 |
| 瓶 |
缓冲 |
弹性蛋白酶 |
底物 |
|
O.D. |
衬底(计算) |
| (No.) |
(ml) |
(ml) |
(ml) |
(mg) |
0 |
0 |
| 1(空白) |
2.0 |
0 |
0 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 2 |
1.9 |
0.1 |
0.02 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 3 |
1.8 |
0.2 |
0.04 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 4 |
1.7 |
0.3 |
0.06 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 5 |
1.6 |
0.4 |
0.08 |
1.0 |
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-------- |
| 6 |
1.5 |
0.5 |
0.10 |
1.0 |
-------- |
-------- |
盖上瓶盖，在37°C下摇晃20分钟. 将烧瓶浸入冰中，用冷缓冲液将体积调至10毫升. 快速过滤No. 41张纸放进试管里读O字.D. 滤出液与坯料的比例. 观察到的记录O.D. 通过将观察到的O除以，计算溶出底物的mg.D. 通过常数O.D. 每毫克在步骤1中确定.
观察到的啊.D.
单位 = mg底物溶解 = O.D./ mg底物
毫克 mg弹性蛋白酶 mg弹性蛋白酶
计算每毫克弹性蛋白酶溶解的基质毫克数. 最后的计算给出了具体的活度. 最广泛使用的弹性溶解活性的单位定义是:一个单位将溶解1毫克弹性蛋白在20分钟pH值8.8和37°C.
未知物质的弹性溶解活性可以用上述程序中未知物质的等分代替弹性蛋白酶来确定. The relative amounts of buffer and unknown can be varied; however, 孵育的最终体积(3毫升), pH值(8.8)和物质的量浓度(0.2 M Tris)必须是常数.
荧光法测定弹性溶解活性
相同的程序(上面)用于测定溶化底物的荧光强度和测定单位弹性活性. 弹性蛋白荧光素和弹性蛋白罗丹明都是合适的底物. 通常，滤液必须用缓冲液稀释，以使荧光强度读数落在荧光计的读出能力之内.
当使用弹性蛋白荧光素作为底物时，将激发波长和发射波长设置为490nm和520nm，读取荧光强度, 分别. 当使用弹性素罗丹明时，激发和发射设置分别为550nm和570 nm.