PPE检测使用NS945

猪胰腺弹性蛋白酶活性的测定 

Suc-Ala-Ala-Ala-pNA (EPC号. NS945)作为衬底(44).

所需的材料

1. Tris buffer; 0.1 M Tris pH 8.3在25ºC.  溶解6.75克Tris-HCl和8.14 G Tris碱900毫升H₂O.  测定25ºC的pH值.  必要时滴定至pH值8.3和0.1m HCl或0.1m NaOH.  用H稀释至1000ml₂O.
    
2. NaOAc-NaCl buffer; 0.05 M NaOAc pH值5，含0.1 M NaCl.  结合14.8毫升0.直升机2米，35.2毫升0.2 M NaOAc和100 ml 0.2 M NaCl. 加入H搅拌至200毫升₂O.  在25ºC滴定至pH值5.
    
3. Substrate solution; 2.5 mM in 0.1 M Tris pH 8.3.  使用25毫克的N-Suc-Ala-Ala-Ala-pNA (EPC No NS945), 用22毫升tris缓冲液溶解内容物.  (注:使用大约10毫升的缓冲液冲洗5次底物小瓶.)搅拌溶解.  储存在5ºC.
    
4. Elastase solution; dissolve 1.0 mg / ml NaOAc-NaCl缓冲液.  准备0的二次溶液.在相同的缓冲液中每毫升10毫克.  将两种溶液放在冰浴中冷藏.
    

过程

1. 将分光光度计调至410 nm，细胞温度调至25ºC.
    
2. 平衡2.5毫升Tris缓冲液和0.5毫升底物溶液到25º的细胞中.
    
3. 添加0.005毫升的0.10mg ml弹性蛋白酶溶液，混合后每隔1分钟测定吸光度的增加率.  加息幅度应该是合理的. 0.025 – 0.040 ∆₄₁₀ 牛米每分钟.

比活度计算

Î, 1%, 280 = 19.5为猪胰腺弹性蛋白酶

mg/ml = A₂₈₀ x 0.51

Vol = 3.005 ml A=410 nm T=25ºC光路=1.0 cm

8.pNA在410 nm处的消光系数为8=mM 

单位  =  ∆A₄₁₀ x 3.005 ml
mg         8.8 x 0.0005 mg